Определение границ инфильтративно растущих глиальных опухолей до настоящего времени остается сложной нерешенной проблемой нейроонкологии. Оптическая когерентная томография (ОКТ) с функцией регистрации кросс-поляризованного (КП) излучения является перспективным методом их выявления при хирургических вмешательствах. Результаты процедур, проводимых с помощью ОКТ, сильно зависят от квалификации врача. Определение границ резекции с использованием метода ОКТ требует количественной оценки получаемых данных. Цель исследования - разработка надежного количественного подхода к оценке КП ОКТ-данных при дифференциации нормальной и опухолевой тканей на модели глиомы крысы. Материалы и методы. Исследование проведено на крысах (n=6) с моделью C6-глиомы, привитой в правое полушарие мозга. Левое полушарие выступало в качестве контрольного. В работе применяли КП ОКТ-устройство, основанное на спектральном принципе приема сигнала. Использование круговой поляризации обеспечивает получение двух ОКТ-изображений: в ко- и кросс-поляризациях. Центральная длина волны зондирующего излучения - 1310 нм, ширина спектра - 100 нм, что обеспечивает аксиальное разрешение 10 мкм. Латеральное разрешение составляет 15 мкм. КП ОКТ-изображения получены ex vivo с использованием бесконтактного торцевого зонда после извлечения мозга и его разреза в сагиттальном направлении. С мозга каждой крысы получены пять наборов КП ОКТ-данных (каждое 3D КП ОКТ-изображение объемом 2,4×2,4×1,25 мм) в следующих областях: на правом полушарии с C6-глиомой в центре опухолевого участка и на границе опухоль-неопухоль (белое вещество); на противоположном полушарии головного мозга (контрольном) на соответствующих неопухолевых областях - сером веществе, границе серого и белого вещества и визуально нормальном белом веществе. Количественная оценка разных типов тканей была основана на вычислении трех оптических показателей: отношения коэффициентов обратного рассеяния, коэффициента затухания и коэффициента кросс-рассеяния вперед. Сканированные с помощью КП ОКТ-участки ткани были маркированы и верифицированы гистологически. Результаты. Построены двухмерные карты распределения коэффициентов в псевдоцвете (color-coded maps) по трем оптическим коэффициентам для нормального серого вещества головного мозга и его границы с белым веществом; для С6-глиомы и ее границы с белым веществом. Карты распределения коэффициентов в псевдоцвете более контрастно показывают границу опухоли по сравнению с en-face (вид сверху) КП ОКТ-изображениями. Продемонстрировано, что каждый из коэффициентов позволяет дифференцировать белое вещество и другие типы изучаемых тканей. Сравнение карт распределения коэффициентов в псевдоцвете C6-глиомы и серого вещества выявило низкую способность рассчитываемых коэффициентов дифференцировать эти ткани. Заключение. Разработан метод количественной оценки 3D КП ОКТ-данных с учетом ко- и кросс-рассеяния. Рассчитанные значения трех оптических коэффициентов для нормальных и опухолевых тканей головного мозга отображены как карты распределения коэффициентов в псевдоцвете. Преимущество обработки КП ОКТ-изображений (построение карт) заключается в более точном определении границ роста опухоли по сравнению с изначально получаемыми интенсивностными изображениями.
Современные технологии в медицине
2018. — Выпуск 1
Содержание:
В ходе исследования у 380 добровольцев зарегистрировано in vivo около 4000 спектров флюоресценции с участков ротовой полости в нормальном (n=133), потенциально злокачественном (n=155) и злокачественном (n=92) состоянии при возбуждении непрерывным волоконным He-Cd лазерой с длиной волны 325 нм. Анализ показал, что суммарные спектры из 7-8 полос возникают в различных видах молекул. В здоровом состоянии (у лиц без патологий полости рта, в том числе связанных с потреблением табачных изделий) слизистые оболочки щек, нижней губы и нижней поверхности языка имеют очень похожие спектры, в то время как спинка языка, его боковая поверхность и небо дают отличные от них и друг от друга спектры. При потенциально злокачественных и злокачественных заболеваниях спектры заметно отличаются на различных участках при различных состояниях. В связи с этим при оптической диагностике целесообразно использовать отдельные эталонные наборы данных о нормальных, потенциально злокачественных или злокачественных состояниях для различных участков.
Ключевые слова
Структурное и морфологическое отображение мягких рассеивающих объектов, таких как биологические ткани, является важной составляющей исследования для разработки средств диагностики. Оптические методы страдают от ограничений, вызванных рассеиванием и поглощением света у такого рода объектов; их применение для глубоких тканей затруднено. В данной работе мы использовали полнопольную оптическую когерентную микроскопию (ПП-ОКМ) с высокой разрешающей способностью, в которой однополосный светоизлучающий диод (470-850 нм) выступает в качестве источника излучения для визуализации рассеивающих биологических объектов. Система ПП-ОКМ основана на геометрии Линника и двухмерной комплементарно-заряженной камеры с оксидным полупроводником (КМОП). Последовательные двухмерные множественные пространственные интерферограммы со сдвинутой фазой получены путем передвижения предметного столика с использованием пьезоэлектрического преобразователя. Впоследствии en-face ПП-ОКМ-изображения были реконструированы с помощью метода быстрых производных. Пространственное разрешение данной системы составляло 0,9 (воздух) и 1,38 мкм аксиально и латерально соответственно. Система была использована для визуализации сильно рассеивающих образцов искусственной модели кожи, лука и рыбьей кожи. Наши результаты демонстрируют возможность системы четко различать структурные особенности рыбьей кожи, о чем свидетельствуют профили распределения интенсивности глубины в разных положениях. Данная система обладает значительной стабильностью, она компактна и экономически эффективна по сравнению с традиционными ПП-ОКМ-системами и может применяться в дальнейшем для того, чтобы отличить здоровую ткань от больной.
Ключевые слова
Цель исследования - изучить способность синего флюоресцентного белка TagBFP к фотоактивации и возможность его применения в микроскопии сверхвысокого разрешения. Материалы и методы. Фотоактивность TagBFP тестировали в белковом растворе in vitro и на живых клетках. Для микроскопии сверхвысокого разрешения использовали режим полного внутреннего отражения флюоресценции с последующим анализом данных методом SRRF (радиальные флюктуации со сверхвысоким разрешением) или посредством реконструкции локализаций одиночных молекул. Результаты. Обнаружено, что при воздействии светом с длиной волны 405 нм можно наблюдать «мигание» флюоресценции белка TagBFP, т.е. обратимые переходы между его темновым и флюоресцентным состояниями. Кроме того, в условиях, обычно используемых для визуализации TagBFP, детектируется переход белка в красное флюоресцентное состояние. При этом спектральные свойства красной (фотоактивированной) формы TagBFP сходны с таковыми его близкого гомолога - TagRFP. Показано, что как «мигание» флюоресценции, так и фотоконверсия TagBFP могут применяться в микроскопии сверхвысокого разрешения. Важно подчеркнуть, что феномен фотоконверсии TagBFP в красное флюоресцентное состояние должен учитываться при планировании экспериментов по многоцветной микроскопии, в условиях интенсивного или длительного воздействия УФ-светом.
Ключевые слова
В данной работе предлагается к рассмотрению альтернативный метод контрастирования в оптической когерентной томографии (ОКТ), основанный на оценке синхронности мигания спеклов структурных ОКТ B-сканов. Показано, что изменения в степени синхронизации мигания спеклов во времени могут быть использованы для выделения различных типов тканей, представляя таким образом новое эффективное контрастирование в ОКТ-визуализации. Разработанная методика проверена на рассеивающих потоковых фантомах и in vivo на раковой опухоли шейки матки, выращенной в смоделированном отверстии дорсальной поверхности кожи мыши. Проведено показательное сравнение полученных значений степени синхронизации спеклов с результатами анализа автокорреляционной функции для демонстрации ее отличий. Фантомные и доклинические результаты in vivo показывают, что предлагаемый синхронизационный подход чувствителен к типу ткани/патологии и позволяет осуществлять количественную оценку опухоли и ее выделение на фоне окружающих здоровых тканей.
Ключевые слова
Оптические и спектральные свойства наноалмазов в настоящее время рассматриваются с точки зрения применения в биомедицинских исследованиях, в частности как флюоресцентные метки для биоимиджинга. Флюоресценция наноалмазов определяется в первую очередь дефектами и примесями в кристаллической решетке. Наиболее хорошо изученными и используемыми флюоресцентыми центрами в наноалмазах являются азотные вакансии. Однако они излучают в видимой области спектра и их излучение перекрывается с автофлюоресценцией большинства биологических объектов. Цель исследования - изучение флюоресценции никелевого центра в наноалмазе, излучающего в ближнем инфракрасном диапазоне (883-885 нм), с точки зрения возможностей его применения для биоимиджинга при однофотонном и двухфотонном возбуждении. Материалы и методы. Использованы синтетические наноалмазы (Kay Diamond, США) с размером частиц от 100 нм до 2,5 мкм и с карбоксилированной поверхностью. Спектральные свойства частиц изучались методами комбинационного рассеяния и люминесцентной спектроскопии при однофотонном и двухфотонном возбуждении. Также изучалось взаимодействие наноалмазов размером 500 нм с клетками baby hamster kidney (BHK). Клетки инкубировались с наноалмазами в течение 8 ч, затем анализировались их изображения, полученные с помощью лазерной конфокальной флюоресцентной сканирующей микроскопии, а также распределение интенсивности фотолюминесценции по изображению. Результаты. Максимум излучения флюоресценции Ni-центра наблюдается на длине волны около 885 нм. Показано, что на флюоресценцию влияют размер частиц наноалмазов, температура, а также условия возбуждения. Вариабельность излучения в зависимости от размеров частиц, температуры, длины волны возбуждения дает возможность выбирать оптимальные нано- или микрочастицы и условия для использования наноалмазов в качестве флюоресцентного зонда. Продемонстрирована возможность наблюдать флюоресценцию Ni-центров в нано- и микроалмазных частицах при двухфотонном возбуждении. Возможность использования Ni-центра в наноалмазах как флюоресцентного зонда при конфокальной флюоресцентной микроскопии, а также для флюоресцентного картирования показана для клеток BHK с наноалмазами размером 500 нм, которые хорошо заметны в цитоплазме клеток. Отмечено отсутствие фотообесцвечивания излучения Ni-центра и повреждение клеток при их взаимодействии с наноалмазами. Заключение. Использование флюоресценции Ni-центра в наноалмазе при однофотонном и двухфотонном возбуждении в качестве маркера для биоимиджинга позволяет наблюдать их вне области автофлюоресценции клеток и в так называемом окне прозрачности биологического объекта. Кроме того, флюоресценция Ni-центра может быть возбуждена более безопасным лазерным излучением в ближней ИК-области.
Ключевые слова
Цель исследования - демонстрация возможности трекинга антистоксовых нанофосфоров (НАФ) состава NaYF4:Yb,Tm, покрытых полиэтиленимином, в живых опухолевых клетках в режиме реального времени с применением широкопольной микроскопии. Материалы и методы. В исследовании использованы клетки аденокарциномы молочной железы человека SK-BR-3 и обладающие антистоксовой фотолюминесценцией наночастицы NaYF4, легированные ионами Yb3+ и Tm3+. Наночастицы были визуализированы с помощью широкопольного микроскопа при возбуждении на длине волны 975 нм и регистрации сигнала в спектральном диапазоне 420-842 нм. Анализ траектории перемещения НАФ был выполнен путем аппроксимации функции рассеяния точки фотолюминесцентных пятен, соответствующих локализации НАФ, функцией Гаусса и посредством расчета среднеквадратичных перемещений. Результаты. Наночастицы быстро интернализовались клетками SK-BR-3 и находились в клетках в течение по меньшей мере 12 ч. Зарегистрированы два типа движения частиц: 1 - изотропные случайные пространственные флюктуации с относительно малыми амплитудами и низкой скоростью перемещения и 2 - резкие направленные движения со скоростью до 1,2 мкм/с и суммарным перемещением до десятков микрометров. Зарегистрированные типы движения можно отнести к диффузии в локальной области и внутриклеточному транспорту наночастиц, заключенных в везикулы, соответственно. Заключение. Трекинг НАФ в клетках аденокарциномы молочной железы человека показал, что наночастицы NaYF4, легированные ионами Yb3+ и Tm3+, являются многообещающим агентом для динамического исследования внутриклеточных процессов. Реализованная схема трекинга НАФ обеспечивает длительное наблюдение при сохранении жизнеспособности клеток в течение как минимум нескольких часов. В совокупности практически полное отсутствие клеточной автофлюоресценции и фотообесцвечивания НАФ, низкая инвазивность, высокая скорость получения изображений позволяют рассматривать предлагаемый подход как перспективный для решения различных задач в биомедицинских исследованиях.
Ключевые слова
Цель исследования - модифицировать химическую структуру и оптимизировать состав фибринового геля для эффективного инкапсулирования клеток. Материалы и методы. Гель на основе модифицированного полиэтиленгликолем (ПЭГ) фибрина был приготовлен с разной концентрацией фибриногена (25-50 мг/мл) и молярным соотношением ПЭГ к фибриногену 10:1 и 5:1 и охарактеризован с помощью Фурье-спектроскопии и дифференциальной сканирующей калориметрии. Внутрь гелей были инкапсулированы фибробласты. Результаты оценивали с помощью световой и лазерной конфокальной микроскопии. Результаты. Модификация фибриногена позволила добиться прозрачности геля и сохранить при этом его биосовместимость. Выявлено, что гель, приготовленный из фибриногена, модифицированного ПЭГ в соотношении 5:1, в концентрации 25 мг/мл, обеспечивает наиболее благоприятные условия для распространения, роста и пролиферации фибробластов. Этот гель может быть использован для инкапсулирования клеток разных типов, что важно для решения задач тканевой инженерии и разработки диагностических систем.
Ключевые слова
Цель исследования - продемонстрировать потенциал атомно-силовой микроскопии (АСМ) в диагностике морфологических изменений во внеклеточном матриксе (ВКМ) соединительной ткани, связанных с патологическими процессами. Представлен авторский опыт по применению АСМ в биомедицинских исследованиях заболеваний соединительной ткани как в научных, так и в клинических целях. Материалы и методы. В зависимости от области применения (экспериментальное или клиническое) образцы получали или от экспериментальных животных, или от пациентов при хирургическом вмешательстве, или post mortem. АСМ-изображения фиксированных срезов ткани получали на микроскопе Solver P47 в полуконтактной моде. Для картирования механических свойств изображения получали на воздухе в моде PeakForce Quantitative Nanomechanical Mapping (PeakForce QNM®) на атомно-силовом микроскопе MultiMode 8 (Bruker, США). Области интереса для сканирования выбирали в соответствии с гистологическими отнесениями для образца на основе изображения этого образца в оптическом микроскопе, совмещенном с атомно-силовым микроскопом. Для количественной параметризации изменений морфологии ВКМ, визуализированных с помощью АСМ, использовали фликкер-шумовую спектроскопию. Результаты. Показано, что АСМ обнаруживает видимые отклонения от нормальной морфологии ВКМ в патологических тканях. АСМ и смежные методики могут прослеживать связанные с патологией изменения на разных уровнях организации коллагена в ВКМ. В микромасштабе АСМ способна детектировать разрыхление и дезорганизацию коллагеновых волокон или обратный процесс их упаковки в плотные параллельные пучки при фиброзе. АСМ может также определять соотношение между коллагеновыми и неволокнистыми компонентами матрикса, например при воспалительном или опухолевом процессе. На уровне коллагеновых фибрилл АСМ может обнаруживать ранние признаки деструкции и ремоделинга ВКМ, невидимые на уровне оптической микроскопии. Параметры фликкер-шумовой спектроскопии обеспечивают количественное описание морфологических изменений, обнаруживаемых АСМ-визуализацией. Методы PeakForce QNM® и наноиндентирования позволяют получить дополнительные данные об изменениях ВКМ по изменению их наномеханических и адгезионных свойств. Данные всех АСМ-исследований хорошо коррелируют с результатами гистологических исследований и зачастую имеют большую чувствительность к патологическим изменениям ВКМ. Заключение. АСМ может служить ценным дополнительным диагностическим методом для отслеживания патологических изменений в соединительной ткани.
Ключевые слова
Цель исследования - изучение про- и антиоксидантной систем, а также энергообразующей функции митохондрий при комбинированной термической травме. Материалы и методы. Эксперимент выполнен на крысах-самцах линии Wistar. Сформировано две группы: 1-я, контрольная (n=10), - интактные здоровые животные; 2-я, опытная (n=10), - животные с комбинированной термической травмой (контактный ожог на площади 20% поверхности тела и термоингаляционное воздействие горячим воздухом и продуктами горения). Животных выводили из эксперимента на 1, 7 и 14-е сутки после травмы путем декапитации под наркозом (Золетил + Ксила). Митохондрии получали путем дифференциального центрифугирования. Для их идентификации проведено электронно-микроскопическое исследование. В митохондриях печени оценивали интенсивность свободнорадикального окисления, активность каталазы, супероксиддисмутазы, сукцинатдегидрогеназы, цитохром с-оксидазы. Результаты исследований обрабатывали с использованием программы Statistica 6.0 (StatSoft Inc., USA). Результаты. Отмечено повышение интенсивности свободнорадикального окисления в митохондриях печени на 7-е и 14-е сутки после травмы. При этом происходило снижение общей антиоксидантной активности плазмы крови и активности каталазы в эритроцитах при термической травме во все исследуемые сутки после ожога по сравнению с контролем. К 7-м и 14-м суткам активность супероксиддисмутазы статистически значимо уменьшилась по сравнению со здоровыми животными. Исследование сукцинатдегидрогеназы и цитохром с-оксидазы показало снижение удельной активности ферментов в митохондриях печени на 1, 7 и 14-е сутки после комбинированной термической травмы. Наиболее выраженное снижение активности сукцинатдегидрогеназы и цитохром с-оксидазы отмечено на 14-е сутки после ожога. Заключение. Выявлены наличие окислительного стресса при комбинированной термической травме, а также комплексный механизм его формирования, подразумевающий как активацию свободнорадикального окисления, так и снижение антиокислительного потенциала с нарушением баланса в функционировании про- и антиоксидантных систем организма. Установлено угнетение энергетического обеспечения клетки, снижение в ней аэробного и усиление анаэробного окисления.
Ключевые слова
В настоящее время в тканевой инженерии широко применяются методы 3D-печати, позволяющие формировать сложные пространственные структуры из различных материалов. Тем не менее создание перспективных композиций для 3D-печати, которые отвечают высоким требованиям, предъявляемым к их биосовместимости и технологичности, по-прежнему остается актуальной задачей. Одним из наиболее привлекательных материалов для копирования живых тканей являются биоактивные гидрогели, обладающие свойствами, близкими к свойствам нативных тканей организма. В работе исследована возможность применения гидрогелей на основе производных гиалуроновой кислоты и полиэтиленгликоля, растворенных в фосфатно-солевом буфере, с использованием рибофлавина мононуклеотида в качестве эндогенного фотосенсибилизатора для 3D-печати различных структур. Формирование слоя гидрогеля в процессе экструзии исходной композиции совмещалось с его одновременным фотоотверждением под действием лазерного излучения на длине волны 450 нм. Цитотоксичность полученных пленок и трехмерных скаффолдов была исследована in vitro с помощью человеческих фибробластов BJ-5ta.
Ключевые слова
Среди функциональных изменений, сопровождающих процесс дифференцировки стволовых клеток, внутриклеточный рН является одним из важнейших параметров. Концентрация протонов в цитоплазме (внутриклеточный рН) также играет ключевую роль в переключении метаболических путей с окислительного фосфорилирования на аэробный гликолиз. Известно, что щелочной рН сопровождает аэробный глизолиз, а окислительное фосфорилирование в свою очередь сопровождается кислым рН. Для изучения динамики рН в настоящее время отдается предпочтение современным флюоресцентным методам исследования. Методы флюоресцентной микроскопии в сочетании с генетически-кодируемыми сенсорами позволяют неинвазивно исследовать в динамике функциональные изменения, лежащие в основе дифференцировки. Цель работы - с использованием флюоресцентной микроскопии и рН-сенсора SypHer-2 исследовать динамические изменения рН в мезенхимных стволовых клетках (МСК), подвергающихся дифференцировке в адипогенном, остеогенном и хондрогенном направлениях. Материалы и методы. Для индукции адипогенной, остеогенной и хондрогенной дифференцировок применяли коммерческие среды. В качестве флюоресцентного зонда использовали генетически-кодируемый рН-сенсор SypHer-2. Для получения временно трансфицированной линии МСК-SypHer-2 была осуществлена электропорация клеток данным белком. Для перевода условных единиц рН в абсолютные единицы была выполнена калибровка с pH-сенсором SypHer-2. Для генетически кодируемого рН-сенсора SypHer-2, имеющего два пика поглощения, флюоресценцию возбуждали лазером на длине волны 405 нм и аргоновым лазером на длине волны 488 нм для каждого пика, с последующей детекцией в диапазоне 500-550 нм. Полученные изображения обрабатывали с помощью программы Image J (NIH, США). Затем определяли соотношение интенсивностей излучения при возбуждении рН-сенсора на длине волны 488 и 405 нм (I488/I405) для каждого значения рН. В соответствии с калибровочной кривой определяли абсолютные значения рН в недифференцированных МСК и МСК при адипогенной, остеогенной и хондрогенной дифференцировках. Данные об изменениях внутриклеточных значений рН получали на 7, 14 и 21-й дни дифференцировок. Результаты. Показано закисление внутриклеточного рН при всех дифференцировках МСК (адипогенной, хондрогенной и остеогенной). Описана взаимосвязь изменений динамики внутриклеточного рН и изменений метаболического статуса стволовых клеток, что ранее никем не проводилось. Значения рН у клеток при адипогенной дифференцировке, меньшие по сравнению с другими видами дифференцировок МСК, связаны, по-видимому, с переносом в цитозоль цитрата, необходимого для биосинтеза жирных кислот и с превращением малата в пируват. Относительно высокие значения рН при остеогенной и хондрогенной дифференцировках, по всей вероятности, обеспечивают высокую активность ферментов, катализирующих процесс окисления пролина и лизина в коллагене при участии аскорбиновой кислоты, в частности пролин- и лизингидроксилазы. Полученные результаты в дальнейшем могут послужить основой для развития эффективных методов оценки дифференцировочных потенций стволовых клеток (в частности, метода оценки внутриклеточного рН как индикатора дифференцировочного статуса клеток), а также стать фундаментом комплексной оценки функциональных изменений в стволовых клеткках человека при направленных дифференцировках на ранних сроках.
Ключевые слова
Цель исследования - изучение морфологических и метаболических особенностей формирования первичных культур клеток гиппокампа на гидрогелевых пленках и скаффолдах, полученных на основе метакрилированной гиалуроновой кислоты. Материалы и методы. На основе метакрилированной гиалуроновой кислоты методом микромолдинга изготовлены гидрогелевые пленки и скаффолды заданной архитектоники. Диссоциированные клетки гиппокампа полученные от 18-дневных эмбрионов мыши линии С57ВL/6 культивировали на разработанных конструктах более 14 дней. На 14-й день культивирования проводили морфометрический анализ, оценку жизнеспособности и анализ спонтанной кальциевой активности первичных гиппокампальных культур. Результаты. Установленно, что материал, применяемый для разработки скаффолда заданной архитектоники, не токсичен для клеток нервной системы. Диссоциированные клетки гиппокампа активно прикреплялись на поверхность скаффолда и образовывали клеточные конгломераты, проявляющие спонтанную кальциевую активность. Заключение. Скаффолды, созданные на основе метакрилированной гиалуроновой кислоты, обладают высокой биосовместимостью с клетками нервной системы. Архитектоника и адгезивные свойства скаффолда способствуют формированию функционально активных клеточных конгломератов.